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蛋白质免疫沉淀步骤
点击次数:349 发布时间:2017-03-28

在网上见到的一篇关于免疫沉淀的文献,较详细,上海恒远现译之共享:
免疫沉淀
材料
1,  蛋白A 或蛋白G
2,  一抗
3,  免疫沉淀缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠.
(> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠 也可作为免疫沉淀的缓冲液,能提高蛋白G的结合功效)
4,  洗脱液:0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5,  SDS-PAGE 上样缓冲液 (pH 6.8): 2% SDS, 62.5 mM Tris 碱, 10% 甘油, 2-5%
2-羟基乙硫醇,
步骤:
1,  用50 µl免疫沉淀缓冲液溶解抗原,向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下,在此体积下2-5µg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。
2,  样品4°C.孵育过夜。
3,  将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中(~ 50 µl of gel per 5 µg of antibody)。
4,  室温下,轻柔混匀样品,孵育2小时。
用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物,离心2-3分钟,弃上清。重复此步骤至少6次。
5,  用50 µl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟,将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来,离心,收集上清。另用50 µl洗脱液孵育胶5分钟,离心,收上清。将两个上清混合。
6,  立即调节蛋白样品的pH至生理值,用一种合适的、多次离心的缓冲液调节,如1.0 M Tris, pH 7.5 (10 µl of this buffer to 100 µl of the supernatant should be sufficient).
7,  将洗脱成分除盐。
8,  准备好样品待定性。

NOTE:如果用SDS-PAGE定性蛋白质,省去步骤6-9。在完成第5步之前,用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟,弃上清。用25µl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心,收集上清。重复一次,汇集上清至总体积50µl。由此样品则准备妥当。

 

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